第十二章 RNA的生物合成

一、RNA轉(zhuǎn)錄合成的特點(diǎn)：

在RNA聚合酶的催化下，以一段DNA鏈為模板合成RNA，從而將DNA所攜帶的遺傳信息傳遞給RNA的過程稱為轉(zhuǎn)錄。經(jīng)轉(zhuǎn)錄生成的RNA有多種，主要的是rRNA，tRNA，mRNA，snRNA和HnRNA。

1.轉(zhuǎn)錄的不對(duì)稱性：指以雙鏈DNA中的一條鏈作為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，從而將遺傳信息由DNA傳遞給RNA。對(duì)于不同的基因來說，其轉(zhuǎn)錄信息可以存在于兩條不同的DNA鏈上。能夠轉(zhuǎn)錄RNA的那條DNA鏈稱為有意義鏈(模板鏈)，而與之互補(bǔ)的另一條DNA鏈稱為反意義鏈(編碼鏈)。

2.轉(zhuǎn)錄的連續(xù)性：RNA轉(zhuǎn)錄合成時(shí)，在RNA聚合酶的催化下，連續(xù)合成一段RNA鏈，各條RNA鏈之間無需再進(jìn)行連接。

3.轉(zhuǎn)錄的單向性：RNA轉(zhuǎn)錄合成時(shí)，只能向一個(gè)方向進(jìn)行聚合，RNA鏈的合成方向?yàn)?’→3’。

4.有特定的起始和終止位點(diǎn)：RNA轉(zhuǎn)錄合成時(shí)，只能以DNA分子中的某一段作為模板，故存在特定的起始位點(diǎn)和特定的終止位點(diǎn)。

二、RNA轉(zhuǎn)錄合成的條件：

1.底物：四種核糖核苷酸，即ATP，GTP，CTP，UTP。

2.模板：以一段單鏈DNA作為模板。

3.RNA聚合酶(DDRP)： RNA聚合酶在單鏈DNA模板以及四種核糖核苷酸存在的條件下，不需要引物，即可從5’→3’聚合RNA。

原核生物中的RNA聚合酶全酶由五個(gè)亞基構(gòu)成，即α2ββ’σ。σ亞基與轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的識(shí)別有關(guān)，而在轉(zhuǎn)錄合成開始后被釋放，余下的部分(α2ββ’)被稱為核心酶，與RNA鏈的聚合有關(guān)。

真核生物中的RNA聚合酶分為三種：RNA polⅠ存在于核仁，對(duì)α-鵝膏蕈堿不敏感，用于合成rRNA前體;RNA polⅡ存在于核基質(zhì)，對(duì)α-鵝膏蕈堿極敏感，用于合成HnRNA;RNA polⅢ存在于核基質(zhì)，對(duì)α-鵝膏蕈堿敏感，用于合成tRNA前體、snRNA及5S rRNA。

4.終止因子ρ蛋白：這是一種六聚體的蛋白質(zhì)，能識(shí)別終止信號(hào)，并能與RNA緊密結(jié)合，導(dǎo)致RNA的釋放。

5.激活因子：降解產(chǎn)物基因激活蛋白(CAP)，又稱為cAMP受體蛋白(CRP)，是一種二聚體蛋白質(zhì)。該蛋白與cAMP結(jié)合后，刺激RNA聚合酶與起始部位結(jié)合，從而起始轉(zhuǎn)錄過程。

三、RNA轉(zhuǎn)錄合成的基本過程：

1.識(shí)別：RNA聚合酶中的σ因子識(shí)別轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，并促使核心酶結(jié)合形成全酶復(fù)合物。

位于基因上游，與RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄有關(guān)的一些DNA順序稱為啟動(dòng)子。在原核生物中的啟動(dòng)子通常長約60bp，存在兩段帶共性的順序，即5’-TTGACA-3’和5’-TATAATG-3’，其中富含TA的順序被稱為Pribnow盒。真核生物的啟動(dòng)子中也存在一段富含TA的順序，被稱為Hogness盒或TATA盒。

2.起始：RNA聚合酶全酶促使局部雙鏈解開，并催化ATP或GTP與另外一個(gè)三磷酸核苷聚合，形成第一個(gè)3’,5’-磷酸二酯鍵。

3.延長：σ因子從全酶上脫離，余下的核心酶繼續(xù)沿DNA鏈移動(dòng)，按照堿基互補(bǔ)原則，不斷聚合RNA。

4.終止：RNA轉(zhuǎn)錄合成的終止機(jī)制有兩種。

⑴自動(dòng)終止：模板DNA鏈在接近轉(zhuǎn)錄終止點(diǎn)處存在相連的富含GC和AT的區(qū)域，使RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物形成寡聚U及發(fā)夾形的二級(jí)結(jié)構(gòu)，引起RNA聚合酶變構(gòu)及移動(dòng)停止，導(dǎo)致RNA轉(zhuǎn)錄的終止。

⑵依賴輔助因子的終止：由終止因子(ρ蛋白)識(shí)別特異的終止信號(hào)，并促使RNA的釋放。

四、真核生物RNA轉(zhuǎn)錄后的加工修飾：

1.mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工：

⑴加帽：即在mRNA的5’-端加上m7GTP的結(jié)構(gòu)。此過程發(fā)生在細(xì)胞核內(nèi)，即對(duì)HnRNA進(jìn)行加帽。加工過程首先是在磷酸酶的作用下，將5’-端的磷酸基水解，然后再加上鳥苷三磷酸，形成GpppN的結(jié)構(gòu)，再對(duì)G進(jìn)行甲基化。

⑵加尾：這一過程也是細(xì)胞核內(nèi)完成，首先由核酸外切酶切去3’-端一些過剩的核苷酸，然后再加入polyA。

⑶剪接：真核生物中的結(jié)構(gòu)基因基本上都是斷裂基因。結(jié)構(gòu)基因中能夠指導(dǎo)多肽鏈合成的編碼順序被稱為外顯子，而不能指導(dǎo)多肽鏈合成的非編碼順序就被稱為內(nèi)含子。真核生物HnRNA的剪接一般需snRNA參與構(gòu)成的核蛋白體參加，通過形成套索狀結(jié)構(gòu)而將內(nèi)含子切除掉。

⑷內(nèi)部甲基化：由甲基化酶催化，對(duì)某些堿基進(jìn)行甲基化處理。

2.tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工：

主要加工方式是切斷和堿基修飾。

3.rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工：

主要加工方式是切斷。

十三章、蛋白質(zhì)生物合成

生物體內(nèi)的各種蛋白質(zhì)都是生物體利用約20種氨基酸為原料自行合成的。蛋白質(zhì)的生物合成過程，就是將DNA傳遞給mRNA的遺傳信息，再具體的解譯為蛋白質(zhì)中氨基酸排列順序的過程，這一過程被稱為翻譯(translation)。參與蛋白質(zhì)生物合成的各種因素構(gòu)成了蛋白質(zhì)合成體系，該體系包括：

1.mRNA：作為指導(dǎo)蛋白質(zhì)生物合成的模板。

mRNA中每三個(gè)相鄰的核苷酸組成三聯(lián)體，代表一個(gè)氨基酸的信息，此三聯(lián)體就稱為密碼。共有64種不同的密碼。遺傳密碼具有以下特點(diǎn)：① 連續(xù)性;② 簡并性;③ 通用性;④ 方向性;⑤ 擺動(dòng)性;⑥ 起始密碼：AUG;終止密碼：UAA、UAG、UGA。

2.tRNA：在氨基酸t(yī)RNA合成酶催化下，特定的tRNA可與相應(yīng)的氨基酸結(jié)合，生成氨基酰tRNA，從而攜帶氨基酸參與蛋白質(zhì)的生物合成。

tRNA反密碼環(huán)中部的三個(gè)核苷酸構(gòu)成三聯(lián)體，可以識(shí)別mRNA上相應(yīng)的密碼，此三聯(lián)體就稱為反密碼。 反密碼對(duì)密碼的識(shí)別，通常也是根據(jù)堿基互補(bǔ)原則，即A—U，G—C配對(duì)。但反密碼的第一個(gè)核苷酸與第三核苷酸之間的配對(duì)，并不嚴(yán)格遵循堿基互補(bǔ)原則，這種配對(duì)稱為不穩(wěn)定配對(duì)。

能夠識(shí)別mRNA中5′端起動(dòng)密碼AUG的tRNA稱為起動(dòng)tRNA。在原核生物中，起動(dòng)tRNA是tRNAfmet;而在真核生物中，起動(dòng)tRNA是tRNAmet。

3.rRNA和核蛋白體：原核生物中的核蛋白體大小為70S，可分為30S小亞基和50S大亞基。真核生物中的核蛋白體大小為80S，也分為40S小亞基和60S大亞基。核蛋白體的大、小亞基分別有不同的功能：

⑴小亞基：可與mRNA、GTP和起動(dòng)tRNA結(jié)合。

⑵大亞基：①具有兩個(gè)不同的tRNA結(jié)合點(diǎn)。A位—— 受位或氨酰基位，可與新進(jìn)入的氨基酰tRNA結(jié)合;P位——給位或肽?；?，可與延伸中的肽酰基tRNA結(jié)合。②具有轉(zhuǎn)肽酶活性。

在蛋白質(zhì)生物合成過程中，常常由若干核蛋白體結(jié)合在同一mRNA分子上，同時(shí)進(jìn)行翻譯。由若干核蛋白體結(jié)合在一條mRNA上同時(shí)進(jìn)行多肽鏈的翻譯所形成的念球狀結(jié)構(gòu)稱為多核蛋白體。

4.起動(dòng)因子(IF)：這是一些與多肽鏈合成起動(dòng)有關(guān)的蛋白因子。原核生物中存在3種起動(dòng)因子，分別稱為IF1-3。在真核生物中存在9種起動(dòng)因子(eIF)。其作用主要是促進(jìn)核蛋白體小亞基與起動(dòng)tRNA及模板mRNA結(jié)合。

5.延長因子(EF)：原核生物中存在3種延長因子(EFTU，EFTS，EFG)，真核生物中存在2種(EF1，EF2)。其作用主要促使氨基酰tRNA進(jìn)入核蛋白的受體，并可促進(jìn)移位過程。

6.釋放因子(RF)：原核生物中有4種，在真核生物中只有1種。其主要作用是識(shí)別終止密碼，協(xié)助多肽鏈的釋放。

7.氨基酰tRNA合成酶：該酶存在于胞液中，與特異氨基酸的活化以及氨基酰tRNA的合成有關(guān)。每種氨基酰tRNA合成酶對(duì)相應(yīng)氨基酸以及攜帶氨基酸的數(shù)種tRNA具有高度特異性。

二、蛋白質(zhì)生物合成過程：

1.氨基酸的活化與搬運(yùn)：氨基酸的活化以及活化氨基酸與tRNA的結(jié)合，均由氨基酰tRNA合成酶催化完成。反應(yīng)完成后，特異的tRNA3’端CCA上的2’或3’位自由羥基與相應(yīng)的活化氨基酸以酯鍵相連接，形成氨基酰tRNA。

2.活化氨基酸的縮合——核蛋白體循環(huán)：活化氨基酸在核蛋白體上反復(fù)翻譯mRNA上的密碼并縮合生成多肽鏈的循環(huán)反應(yīng)過程，稱為核蛋白體循環(huán)。核蛋白體循環(huán)過程可分為三個(gè)階段：

⑴起動(dòng)階段：①30S起動(dòng)復(fù)合物的形成。在IF促進(jìn)下，30S小亞基與mRNA的起動(dòng)部位，起動(dòng)tRNA(tRNAfmet)，和GTP結(jié)合，形成復(fù)合體。②70S起動(dòng)前復(fù)合體的形成。IF3從30S起動(dòng)復(fù)合體上脫落，50S大亞基與復(fù)合體結(jié)合，形成70S起動(dòng)前復(fù)合體。③70S起動(dòng)復(fù)合體的形成。GTP被水解，IF1和IF2從復(fù)合物上脫落。

⑵肽鏈延長階段：①進(jìn)位：與mRNA下一個(gè)密碼相對(duì)應(yīng)的氨基酰tRNA進(jìn)入核蛋白體的受位。此步驟需GTP，Mg2+，和EF參與。②成肽：在轉(zhuǎn)肽酶的催化下，將給位上的tRNA所攜帶的甲酰蛋氨?；螂孽；D(zhuǎn)移到受位上的氨基酰tRNA上，與其α-氨基縮合形成肽鍵。給位上已失去蛋氨?；螂孽；膖RNA從核蛋白上脫落。③移位：核蛋白體向mRNA的3’- 端滑動(dòng)相當(dāng)于一個(gè)密碼的距離，同時(shí)使肽?；鵷RNA從受體移到給位。此步驟需EF(EFG)、GTP和Mg2+參與。 此時(shí)，核蛋白體的受位留空，與下一個(gè)密碼相對(duì)應(yīng)的氨基酰tRNA即可再進(jìn)入，重復(fù)以上循環(huán)過程，使多肽鏈不斷延長。

⑶肽鏈終止階段：核蛋白體沿mRNA鏈滑動(dòng)，不斷使多肽鏈延長，直到終止信號(hào)進(jìn)入受位。①識(shí)別：RF識(shí)別終止密碼，進(jìn)入核蛋白體的受位。②水解：RF使轉(zhuǎn)肽酶變?yōu)樗饷?，多肽鏈與tRNA之間的酯鍵被水解，多肽鏈釋放。③解離：通過水解GTP，使核蛋白體與mRNA分離，tRNA、RF脫落，核蛋白體解離為大、小亞基。

三、多肽鏈合成后的加工修飾：

1.一級(jí)結(jié)構(gòu)的加工修飾：

⑴N端甲酰蛋氨酸或蛋氨酸的切除：N端甲酰蛋氨酸是多肽鏈合成的起始氨基酸，必須在多肽鏈折迭成一定的空間結(jié)構(gòu)之前被切除。其過程是：① 去甲?；?② 去蛋氨酰基。

⑵氨基酸的修飾：由專一性的酶催化進(jìn)行修飾，包括糖基化、羥基化、磷酸化、甲?；取?/p>

⑶二硫鍵的形成：由專一性的氧化酶催化，將-SH氧化為-S-S-。

⑷肽段的切除：由專一性的蛋白酶催化，將部分肽段切除。

2.高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成：

⑴構(gòu)象的形成：在分子內(nèi)伴侶、輔助酶及分子伴侶的協(xié)助下，形成特定的空間構(gòu)象。

⑵亞基的聚合。

⑶輔基的連接。

3.靶向輸送：蛋白質(zhì)合成后，定向地被輸送到其執(zhí)行功能的場所稱為靶向輸送。大多數(shù)情況下，被輸送的蛋白質(zhì)分子需穿過膜性結(jié)構(gòu)，才能到達(dá)特定的地點(diǎn)。因此，在這些蛋白質(zhì)分子的氨基端，一般都帶有一段疏水的肽段，稱為信號(hào)肽。分泌型蛋白質(zhì)的定向輸送，就是靠信號(hào)肽與胞漿中的信號(hào)肽識(shí)別粒子(SRP)識(shí)別并特異結(jié)合，然后再通過SRP與膜上的對(duì)接蛋白(DP)識(shí)別并結(jié)合后，將所攜帶的蛋白質(zhì)送出細(xì)胞。

第十四章 基因表達(dá)調(diào)控

一、基因表達(dá)調(diào)控基本概念與原理：

1.基因表達(dá)的概念：基因表達(dá)(gene expression)就是指在一定調(diào)節(jié)因素的作用下，DNA分子上特定的基因被激活并轉(zhuǎn)錄生成特定的RNA，或由此引起特異性蛋白質(zhì)合成的過程。

2.基因表達(dá)的時(shí)間性及空間性：

⑴時(shí)間特異性：基因表達(dá)的時(shí)間特異性(temporal specificity)是指特定基因的表達(dá)嚴(yán)格按照特定的時(shí)間順序發(fā)生，以適應(yīng)細(xì)胞或個(gè)體特定分化、發(fā)育階段的需要。故又稱為階段特異性。

⑵空間特異性：基因表達(dá)的空間特異性(spatial specificity)是指多細(xì)胞生物個(gè)體在某一特定生長發(fā)育階段，同一基因的表達(dá)在不同的細(xì)胞或組織器官不同，從而導(dǎo)致特異性的蛋白質(zhì)分布于不同的細(xì)胞或組織器官。故又稱為細(xì)胞特異性或組織特異性。

3.基因表達(dá)的方式：

⑴組成性表達(dá)：組成性基因表達(dá)(constitutive gene expression)是指在個(gè)體發(fā)育的任一階段都能在大多數(shù)細(xì)胞中持續(xù)進(jìn)行的基因表達(dá)。其基因表達(dá)產(chǎn)物通常是對(duì)生命過程必需的或必不可少的，且較少受環(huán)境因素的影響。這類基因通常被稱為管家基因(housekeeping gene)。

⑵誘導(dǎo)和阻遏表達(dá)：誘導(dǎo)表達(dá)(induction)是指在特定環(huán)境因素刺激下，基因被激活，從而使基因的表達(dá)產(chǎn)物增加。這類基因稱為可誘導(dǎo)基因。阻遏表達(dá)(repression)是指在特定環(huán)境因素刺激下，基因被抑制，從而使基因的表達(dá)產(chǎn)物減少。這類基因稱為可阻遏基因。

4.基因表達(dá)的生物學(xué)意義：①適應(yīng)環(huán)境、維持生長和增殖。②維持個(gè)體發(fā)育與分化。

5.基因表達(dá)調(diào)控的基本原理：

⑴基因表達(dá)的多級(jí)調(diào)控：基因表達(dá)調(diào)控可見于從基因激活到蛋白質(zhì)生物合成的各個(gè)階段，因此基因表達(dá)的調(diào)控可分為轉(zhuǎn)錄水平(基因激活及轉(zhuǎn)錄起始)，轉(zhuǎn)錄后水平(加工及轉(zhuǎn)運(yùn))，翻譯水平及翻譯后水平，但以轉(zhuǎn)錄水平的基因表達(dá)調(diào)控最重要。

⑵基因轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)基本要素：①順式作用元件：順式作用元件(cis-acting element)又稱分子內(nèi)作用元件，指存在于DNA分子上的一些與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)的特殊順序。②反式作用因子：反式作用因子(trans-acting factor)又稱為分子間作用因子，指一些與基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)的蛋白質(zhì)因子。反式作用因子與順式作用元件之間的共同作用，才能夠達(dá)到對(duì)特定基因進(jìn)行調(diào)控的目的。③順式作用元件與反式作用因子之間的相互作用：大多數(shù)調(diào)節(jié)蛋白在與DNA結(jié)合之前，需先通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，形成二聚體或多聚體，然后再通過識(shí)別特定的順式作用元件，而與DNA分子結(jié)合。這種結(jié)合通常是非共價(jià)鍵結(jié)合。

二、操縱子的結(jié)構(gòu)與功能：

在原核生物中，若干結(jié)構(gòu)基因可串聯(lián)在一起，其表達(dá)受到同一調(diào)控系統(tǒng)的調(diào)控，這種基因的組織形式稱為操縱子。典型的操縱子可分為控制區(qū)和信息區(qū)兩部分。信息區(qū)由一個(gè)或數(shù)個(gè)結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)在一起組成;控制區(qū)通常由調(diào)節(jié)基因(阻抑蛋白編碼基因)、啟動(dòng)基因(CRP和RNA聚合酶結(jié)合區(qū))和操縱基因(阻抑蛋白結(jié)合位點(diǎn))構(gòu)成。

1.原核生物乳糖操縱子：

原核生物乳糖操縱子(Lac operon)的控制區(qū)包括調(diào)節(jié)基因，啟動(dòng)基因(其CRP結(jié)合位點(diǎn)位于RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)上游)和操縱基因;其信息區(qū)由β-半乳糖苷酶基因(lacZ)，通透酶基因(lacY)和乙酰化酶基因(lacA)串聯(lián)在一起構(gòu)成。當(dāng)培養(yǎng)基中乳糖濃度升高而葡萄糖濃度降低時(shí)，乳糖作為誘導(dǎo)劑與阻抑蛋白結(jié)合，促使阻抑蛋白與操縱基因分離;另一方面，細(xì)胞中cAMP濃度升高，cAMP與CRP結(jié)合并使之激活，CRP與啟動(dòng)基因結(jié)合并促使RNA聚合酶與啟動(dòng)基因結(jié)合，基因轉(zhuǎn)錄激活。

2.原核生物色氨酸操縱子：

色氨酸操縱子(trp operon)屬于阻遏型操縱子，主要調(diào)控一系列用于色氨酸合成代謝的酶蛋白的轉(zhuǎn)錄合成。色氨酸操縱子通常處于開放狀態(tài)，其輔阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合而阻遏轉(zhuǎn)錄。而當(dāng)色氨酸合成過多時(shí)，色氨酸作為輔阻遏物與輔阻遏蛋白結(jié)合而形成阻遏蛋白，后者與操縱基因結(jié)合而使基因轉(zhuǎn)錄關(guān)閉。色氨酸操縱子的調(diào)控還涉及轉(zhuǎn)錄衰減(attenuation)機(jī)制。即在色氨酸操縱子第一個(gè)結(jié)構(gòu)基因與啟動(dòng)基因之間存在有一衰減區(qū)域，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)色氨酸酸濃度很高時(shí)，通過與轉(zhuǎn)錄相偶聯(lián)的翻譯過程，形成一個(gè)衰減子結(jié)構(gòu)，使RNA聚合酶從DNA上脫落，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄終止。

3.原核生物轉(zhuǎn)錄的整體調(diào)控模式：

由成群的操縱子組成的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)稱為調(diào)節(jié)子。通過組成調(diào)節(jié)子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對(duì)若干操縱子及若干蛋白質(zhì)的合成進(jìn)行協(xié)同調(diào)控，從而達(dá)到整體調(diào)控的目的。典型的整體調(diào)控模式是SOS反應(yīng)，這是由一組與DNA損傷修復(fù)有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)基因組成。在正常情況下，這些基因均被LexA阻遏蛋白封閉。當(dāng)有紫外線照射時(shí)，細(xì)菌體內(nèi)的RecA蛋白水解酶被激活，催化LexA阻遏蛋白裂解失活，從而導(dǎo)致與DNA損傷修復(fù)有關(guān)的基因表達(dá)。

三、真核基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：

1.轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子：真核基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物一般是單順反子(mono-cistron)，即一個(gè)編碼基因轉(zhuǎn)錄生成一個(gè)mRNA分子，并指導(dǎo)翻譯一條多肽鏈。

2.大量重復(fù)序列：真核基因組中含大量的重復(fù)序列，這些重復(fù)序列大部分是沒有特定生物學(xué)功能的DNA片段，可占整個(gè)基因組DNA的90%。根據(jù)重復(fù)頻率可將其分為高度重復(fù)序列、中度重復(fù)序列和單拷貝序列。

3.斷裂基因：真核生物中的基因具有不連續(xù)性，即一個(gè)基因的編碼序列往往被一些非編碼序列分隔開?；蛑心軌蜣D(zhuǎn)錄并進(jìn)一步編碼多肽鏈合成的部分稱為外顯子(exon)，而在轉(zhuǎn)錄后會(huì)被剪除的部分則稱為內(nèi)含子(intron)。

三、真核基因表達(dá)調(diào)控的特點(diǎn)：

1.RNA聚合酶活性受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控：真核生物中存在RNA polⅠ、Ⅱ、Ⅲ三種不同的RNA聚合酶，分別負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄不同的RNA。這些RNA聚合酶與相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合體，從而激活或抑制該酶的催化活性。

2.染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變參與基因表達(dá)的調(diào)控：真核生物DNA與組蛋白結(jié)合并形成核小體的結(jié)構(gòu)，再進(jìn)一步形成染色質(zhì)。當(dāng)真核基因被激活時(shí)，染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)也隨之發(fā)生改變。主要的改變有：

⑴單鏈DNA形成：基因被激活后，雙鏈DNA解開成單鏈以利于轉(zhuǎn)錄，從而形成一些對(duì)DNAaseⅠ的超敏位點(diǎn)。

⑵DNA拓樸結(jié)構(gòu)改變：天然雙鏈DNA均以負(fù)性超螺旋構(gòu)象存在，當(dāng)基因激活后，則轉(zhuǎn)錄區(qū)前方的DNA拓樸結(jié)構(gòu)變?yōu)檎猿菪?。正性超螺旋可阻礙核小體形成，并促進(jìn)組蛋白解聚。

⑶核小體不穩(wěn)定性增加：由于組蛋白修飾狀態(tài)改變，巰基暴露等原因而引起核小體結(jié)構(gòu)改變。

4.正性調(diào)節(jié)占主導(dǎo)：真核基因一般都處于阻遏狀態(tài)，RNA聚合酶對(duì)啟動(dòng)子的親和力很低。通過利用各種轉(zhuǎn)錄因子正性激活RNA聚合酶是真核基因調(diào)控的主要機(jī)制。

5.轉(zhuǎn)錄和翻譯過程分別進(jìn)行：轉(zhuǎn)錄與翻譯過程分別存在于不同的亞細(xì)胞部位，可分別進(jìn)行調(diào)控。

6.轉(zhuǎn)錄后加工修飾過程復(fù)雜：特別是mRNA，轉(zhuǎn)錄后僅形成其初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物——HnRNA，然后再經(jīng)剪接、加帽、加尾等加工修飾，才能轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓膍RNA。

四、真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件及激活機(jī)制：

1.順式作用元件(分子內(nèi)作用元件)：

⑴啟動(dòng)子：存在于結(jié)構(gòu)基因上游，與基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)有關(guān)的一段特殊DNA順序稱為啟動(dòng)子。與原核生物類似，也含有一段富含TATA的順序，稱為TATA盒。除此之外，還可見CAAT盒和GC盒。

⑵增強(qiáng)子：位于結(jié)構(gòu)基因附近，能夠增強(qiáng)該基因轉(zhuǎn)錄活性的一段DNA順序稱為增強(qiáng)子。增強(qiáng)子的特點(diǎn)是：①在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)5’或3’側(cè)均能起作用;②相對(duì)于啟動(dòng)子的任一指向均能起作用;③發(fā)揮作用與受控基因的遠(yuǎn)近距離相對(duì)無關(guān);④對(duì)異源性啟動(dòng)子也能發(fā)揮作用;⑤通常具有一些短的重復(fù)順序。

⑶沉默子：能夠?qū)蜣D(zhuǎn)錄起阻遏作用的DNA片段，屬于負(fù)性調(diào)控元件。

2.反式作用因子(分子間作用因子)：真核生物反式作用因子通常屬于轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor，TF)。

(1)轉(zhuǎn)錄因子的種類：①非特異性轉(zhuǎn)錄因子(基本轉(zhuǎn)錄因子)：非選擇性調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的蛋白質(zhì)因子稱為非特異性轉(zhuǎn)錄因子。真核生物中存在的三種RNA聚合酶分別有相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，即TFⅠ，TFⅡ，TFⅢ。其中，TFⅡ一共有六種亞類。TFⅡD是唯一能識(shí)別啟動(dòng)子TATA盒并與之結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，而TFⅡB則可促進(jìn)聚合酶Ⅱ與啟動(dòng)子的結(jié)合。②特異性轉(zhuǎn)錄因子：能夠選擇性調(diào)控某種或某些基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的蛋白質(zhì)因子稱為特異性轉(zhuǎn)錄因子。目前較清楚的是調(diào)控免疫球蛋白基因表達(dá)的核內(nèi)蛋白質(zhì)因子(NF)。

(2)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)：反式作用因子至少含有三個(gè)功能域，即DNA結(jié)合功能域，轉(zhuǎn)錄活性功能域和其它轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合功能域。DNA結(jié)合功能域帶共性的結(jié)構(gòu)主要有：①HTH和HLH結(jié)構(gòu)： 由兩段α-螺旋夾一段β-折迭構(gòu)成，α-螺旋與β-折迭之間通過β-轉(zhuǎn)角或成環(huán)連接，即螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)和螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)。②鋅指結(jié)構(gòu)：見于TFⅢA和類固醇激素受體中，由一段富含半胱氨酸的多肽鏈構(gòu)成。每四個(gè)半光氨酸殘基或His殘基螯合一分子Zn2+，其余約12-13個(gè)殘基則呈指樣突出，剛好能嵌入DNA雙螺旋的大溝中而與之相結(jié)合。③亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)：見于真核生物DNA結(jié)合蛋白的C端，與癌基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)。由兩段α-螺旋平行排列構(gòu)成，其α-螺旋中存在每隔7個(gè)殘基規(guī)律性排列的Leu殘基，Leu側(cè)鏈交替排列而呈拉鏈狀。兩條肽鏈呈鉗狀與DNA相結(jié)合。

⑶轉(zhuǎn)錄因子的作用特點(diǎn)：①同一DNA順式作用元件可被不同的轉(zhuǎn)錄因子所識(shí)別;②同一轉(zhuǎn)錄因子也可識(shí)別不同的DNA順式作用元件;③TF與TF之間存在相互作用;④當(dāng)TF與TF，TF與DNA結(jié)合時(shí)，可導(dǎo)致構(gòu)象改變;⑤TF在合成過程中，有較大的可變性和可塑性。

3.轉(zhuǎn)錄激活及其調(diào)控：真核RNA聚合酶Ⅱ的激活需要依賴多種轉(zhuǎn)錄因子，并與之形成復(fù)合體。其過程首先是由TFⅡD識(shí)別啟動(dòng)子序列并與之結(jié)合;繼而RNA聚合酶Ⅱ與TFⅡD、B等聚合形成一個(gè)功能性的前起始復(fù)合體——PIC;最后，結(jié)合了增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄因子與前起始復(fù)合體結(jié)合，從而形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體。

第十五章 基因重組和基因工程

一、自然界的基因轉(zhuǎn)移和重組：

基因重組(gene recombination)是指DNA片段在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞間，甚至在不同物種之間進(jìn)行交換，交換后的片段仍然具有復(fù)制和表達(dá)的功能。

1.接合作用：當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞相互接觸時(shí)，DNA分子即從一個(gè)細(xì)胞向另一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移，這種遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移方式稱為接合作用(conjugation)。

2.轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染：由外來DNA引起生物體遺傳性狀改變的過程稱為轉(zhuǎn)化(transformation)。噬菌體常?？筛腥炯?xì)菌并將其DNA注入細(xì)菌體內(nèi)，也可引起細(xì)菌遺傳性狀的改變。通過感染方式將外來DNA引入宿主細(xì)胞，并導(dǎo)致宿主細(xì)胞遺傳性狀改變的過程稱為轉(zhuǎn)染(transfection)。轉(zhuǎn)染是轉(zhuǎn)化的一種特殊形式。

3.整合和轉(zhuǎn)導(dǎo):外來DNA侵入宿主細(xì)胞，并與宿主細(xì)胞DNA進(jìn)行重組，成為宿主細(xì)胞DNA的一部分，這一過程稱為整合。整合在宿主細(xì)胞染色體DNA中的外來DNA，可以被切離出來，同時(shí)也可帶走一部分的宿主DNA，這一過程稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)。來源于宿主DNA的基因稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)基因。

4.轉(zhuǎn)座：轉(zhuǎn)座又稱為轉(zhuǎn)位(transposition)，是指DNA的片段或基因從基因組的一個(gè)位置轉(zhuǎn)移到另一個(gè)位置的現(xiàn)象。這些能夠在基因組中自由游動(dòng)的DNA片段包括插入序列和轉(zhuǎn)座子兩種類型。

⑴插入序列：典型的插入序列(insertion sequence，IS)是長750-1500bp的DNA片段，由兩個(gè)分離的反向重復(fù)序列和一個(gè)轉(zhuǎn)座酶基因。當(dāng)轉(zhuǎn)座酶基因表達(dá)時(shí)，即可引起該序列的轉(zhuǎn)座。其轉(zhuǎn)座方式主要有保守性轉(zhuǎn)座和復(fù)制性轉(zhuǎn)座。

⑵轉(zhuǎn)座子：轉(zhuǎn)座子(transposons)是可從一個(gè)染色體位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一個(gè)位點(diǎn)的分散的重復(fù)序列，含兩個(gè)反向重復(fù)序列、一個(gè)轉(zhuǎn)座酶基因和其他基因(如抗生素抗性基因)。

免疫球蛋白重鏈基因由一組可變區(qū)基因(VH)和一組恒定區(qū)基因(CH)構(gòu)成，通過這些基因的選擇性轉(zhuǎn)座和重組，就可以轉(zhuǎn)錄表達(dá)出各種各樣的免疫球蛋白重鏈，以對(duì)付不同的抗原。

5.基因重組的方式：

⑴位點(diǎn)特異性重組：在整合酶的催化下，兩段DNA序列的特異的位點(diǎn)處發(fā)生整合并共價(jià)連接，稱為位點(diǎn)特異性重組。

⑵同源重組：發(fā)生在同源DNA序列之間的重組稱為同源重組(homologous recombination)。這種重組方式要求兩段DNA序列類似，并在特定的重組蛋白或酶的作用下完成。

二、重組DNA技術(shù)：

重組DNA技術(shù)又稱為基因工程(genetic engineering)或分子克隆(molecular cloning)，是指采用人工方法將不同來源的DNA進(jìn)行重組，并將重組后的DNA引入宿主細(xì)胞中進(jìn)行增殖或表達(dá)的過程。

1.載體和目的基因的分離(分)：對(duì)載體DNA和目的基因分別進(jìn)行分離純化，得到其純品。

⑴載體：常用的載體(vector)主要包括質(zhì)粒(plasmid)、噬菌體(phage)和病毒(virus)三大類。這些載體均需經(jīng)人工構(gòu)建，除去致病基因，并賦予一些新的功能，如有利于進(jìn)行篩選的標(biāo)志基因、單一的限制酶切點(diǎn)等。①質(zhì)粒：是存在于天然細(xì)菌體內(nèi)的一種獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外的雙鏈環(huán)狀DNA，具有獨(dú)立復(fù)制的能力，通常帶有細(xì)菌的抗藥基因。②噬菌體：可通過轉(zhuǎn)染方式將其DNA送入細(xì)菌體內(nèi)進(jìn)行增殖。常用的為人工構(gòu)建的λ噬菌體載體，當(dāng)目的基因與噬菌體DNA進(jìn)行重組時(shí)，可采用插入重組方式，也可采用置換重組方式。③病毒：常用的為SV40，通過感染方式將其DNA送入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行增殖。

⑵目的基因：①直接從染色體DNA中分離：僅適用于原核生物基因的分離。②人工合成：根據(jù)已知多肽鏈的氨基酸順序，利用遺傳密碼表推定其核苷酸順序再進(jìn)行人工合成。適應(yīng)于編碼小分子多肽的基因。③從mRNA合成cDNA：采用一定的方法釣取特定基因的mRNA，再通過逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成其互補(bǔ)DNA(cDNA)，除去RNA鏈后，再用DNA聚合酶合成其互補(bǔ)DNA鏈，從而得到雙鏈DNA。④從基因文庫中篩選：將某一種基因DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖袛嗪?，與載體DNA重組，再全部轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到含全部基因組DNA的種群，稱為G文庫(genomic DNA library)。將某種細(xì)胞的全部mRNA通過逆轉(zhuǎn)合成cDNA，然后轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到含全部表達(dá)基因的種群，稱為C-文庫(cDNA library)。C-文庫具有組織細(xì)胞特異性。⑤利用PCR合成：如已知目的基因兩端的序列，則可采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)技術(shù)，在體外合成目的基因。

2.載體和目的基因的切斷(切)：通常采用限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease)，簡稱限制酶，分別對(duì)載體DNA和目的基因進(jìn)行切斷，以便于重組。能夠識(shí)別特定的堿基順序并在特定的位點(diǎn)降解核酸的核酸內(nèi)切酶稱為限制酶。限制酶所識(shí)別的順序往往為4-8個(gè)堿基對(duì)，且有回文結(jié)構(gòu)。由限制酶切斷后的末端可形成平端、3’-突出粘性末端和5’-突出粘性末端三種情況。形成粘性末端(cohesive end)者較有利于載體DNA和目的基因的重組。

3.載體和目的基因的重組(接)：即將帶有切口的載體與所獲得的目的基因連接起來，得到重新組合后的DNA分子。

⑴粘性末端連接法：載體與目的基因通過粘性末端進(jìn)行互補(bǔ)粘合，再加入DNA連接酶，即可封閉其缺口，得到重組體。

⑵人工接尾法：即同聚物加尾連接法。在末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下，將脫氧核糖核苷酸添加于載體或目的基因的3’-端，如載體上添加一段polyG，則可在目的基因上添加一段polyC，通過堿基互補(bǔ)進(jìn)行粘合后，再由DNA連接酶連接。

⑶人工接頭連接法：將人工連接器(即一段含有多種限制酶切點(diǎn)的DNA片段)連接到載體和目的基因上，即有可能使用同一種限制酶對(duì)載體和目的基因進(jìn)行切斷，得到可以互補(bǔ)的粘性末端。

4.重組DNA的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增(轉(zhuǎn))：將重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行增殖或表達(dá)。重組質(zhì)?？赏ㄟ^轉(zhuǎn)化方式導(dǎo)入宿主細(xì)胞，λ噬菌體作為載體的重組體，則需通過轉(zhuǎn)染方式將重組噬菌體DNA導(dǎo)入大腸桿菌等宿主細(xì)胞。重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，即可在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)以擴(kuò)增宿主細(xì)胞。

5.重組DNA的篩選和鑒定(篩)：對(duì)含有重組體的宿主細(xì)胞進(jìn)行篩選并作鑒定。

⑴根據(jù)重組體的表型進(jìn)行篩選：對(duì)于帶有抗藥基因的質(zhì)粒重組體，可采用插入滅活法進(jìn)行篩選。

⑵根據(jù)標(biāo)志互補(bǔ)進(jìn)行篩選：當(dāng)宿主細(xì)胞存在某種基因及其表達(dá)產(chǎn)物的缺陷時(shí)，可采用此方法篩選重組體。即在載體DNA分子中插入相應(yīng)的缺陷基因，如宿主細(xì)胞重新獲得缺陷基因的表達(dá)產(chǎn)物，則說明該細(xì)胞中帶有重組體。

⑶根據(jù)DNA限制酶譜進(jìn)行分析：經(jīng)過粗篩后的含重組體的細(xì)菌，還需進(jìn)行限制酶譜分析進(jìn)一步鑒定。

⑷用核酸雜交法進(jìn)行分析鑒定：采用與目的基因部分互補(bǔ)的DNA片段作為探針，與含有重組體的細(xì)菌菌落進(jìn)行雜交，以確定重組體中帶目的基因。

獲得帶目的基因的細(xì)菌后，可將其不斷進(jìn)行增殖，從而得到大量的目的基因片段用于分析研究。如在目的基因的上游帶有啟動(dòng)子順序，則目的基因還可轉(zhuǎn)錄表達(dá)合成蛋白質(zhì)。

第十六章 細(xì)胞信息傳遞

一、細(xì)胞間信息物質(zhì)：

凡是由細(xì)胞分泌的、能夠調(diào)節(jié)特定的靶細(xì)胞生理活動(dòng)的化學(xué)物質(zhì)都稱為細(xì)胞間信息物質(zhì)，或第一信使。

1.激素：激素(hormone)是由特殊分化細(xì)胞合成并分泌的一類生理活性物質(zhì)，這些物質(zhì)通過體液進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，作用于特定的靶細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞的物質(zhì)代謝或生理活動(dòng)。

⑴激素的分類：激素可按照其化學(xué)本質(zhì)的不同分為四類。①類固醇衍生物：如腎上腺皮質(zhì)激素、性激素等;②氨基酸衍生物：如甲狀腺激素，兒茶酚胺類激素;③多肽及蛋白質(zhì)：如胰島素、下丘腦激素、垂體激素等;④脂肪酸衍生物：如前列腺素。

⑵激素的作用方式：①自分泌：激素分泌釋放后仍作用于自身細(xì)胞，其傳遞介質(zhì)為胞液;②旁分泌：激素分泌釋放后作用于鄰近的靶細(xì)胞，其傳遞介質(zhì)為細(xì)胞間液。③內(nèi)分泌：激素分泌后作用較遠(yuǎn)的靶細(xì)胞，其傳遞介質(zhì)為血液。

2.細(xì)胞因子：細(xì)胞因子是指由細(xì)胞分泌的一類信息分子，可作用于特定的靶細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長，分化等生理功能。細(xì)胞因子也可通過自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌三種方式作用于特定的靶細(xì)胞。

常見的細(xì)胞因子有：表皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、胰島素樣生長因子(IGF)等。

3.神經(jīng)遞質(zhì)：由神經(jīng)元突觸前膜釋放的信息物質(zhì)，可作用于突觸后膜上的受體，傳遞神經(jīng)沖動(dòng)信號(hào)。

二、細(xì)胞內(nèi)信息物質(zhì)：

存在于細(xì)胞內(nèi)，能夠傳遞特定調(diào)控信號(hào)的化學(xué)物質(zhì)稱為細(xì)胞內(nèi)信息物質(zhì)。

1.第二信使：在細(xì)胞內(nèi)傳遞信息的小分子化學(xué)物質(zhì)稱為第二信使。① 環(huán)核苷酸類：如cAMP和cGMP;② 脂類衍生物：如甘油二脂(DAG)，1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)，花生四烯酸等。③ 無機(jī)物：如Ca2+、NO等。

2.信號(hào)蛋白：細(xì)胞膜上或細(xì)胞內(nèi)能夠傳遞特定信號(hào)的蛋白質(zhì)分子，常與其他蛋白質(zhì)或酶構(gòu)成復(fù)合體以傳遞信息。如G蛋白、連接蛋白(SOS，GRB2)、鳥苷酸交換蛋白(GEF)、GTPase激活蛋白(GAP)等。

3.信號(hào)酶：細(xì)胞內(nèi)能夠傳遞特定調(diào)控信號(hào)的酶蛋白分子。如胰島素受體底物-1/2(IRS1/2)、 MAPKKK(Raf-1)、MAPKK(MEK-1/2)、MAPK(ERK1/2)、PKA、PKB、PKC、PKG、PAK、PDK、CaMPK等。

三、受體的分類、結(jié)構(gòu)與功能：

受體(receptor)是指存在于靶細(xì)胞膜上或細(xì)胞內(nèi)的一類特殊蛋白質(zhì)分子，它們能識(shí)別特異性的配體并與之結(jié)合，產(chǎn)生各種生理效應(yīng)。

1.根據(jù)受體的亞細(xì)胞定位分類：

⑴細(xì)胞膜受體：這類受體是細(xì)胞膜上的結(jié)構(gòu)成分，一般是糖蛋白、脂蛋白或糖脂蛋白。多肽及蛋白質(zhì)類激素、兒茶酚胺類激素、前列腺素以及細(xì)胞因子通過這類受體進(jìn)行跨膜信號(hào)傳遞。

⑵細(xì)胞內(nèi)受體：這類受體位于細(xì)胞液或細(xì)胞核內(nèi)，通常為單純蛋白質(zhì)。此型受體主要包括類固醇激素受體，維生素D3受體(VDR)以及甲狀腺激素受體(TR)。

2.根據(jù)受體的分子結(jié)構(gòu)分類：

⑴配體門控離子通道型受體：此型受體本身就是位于細(xì)胞膜上的離子通道。其共同結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是由均一性的或非均一性的亞基構(gòu)成一寡聚體，而每個(gè)亞基則含有4~6個(gè)跨膜區(qū)。此型受體包括煙堿樣乙酰膽堿受體(N-AchR)、A型γ-氨基丁酸受體(GABAAR)、谷氨酸受體等。

⑵G蛋白偶聯(lián)型受體：此型受體通常由單一的多肽鏈或均一的亞基組成，其肽鏈可分為細(xì)胞外區(qū)、跨膜區(qū)、細(xì)胞內(nèi)區(qū)三個(gè)區(qū)。在第五及第六跨膜α螺旋結(jié)構(gòu)之間的細(xì)胞內(nèi)環(huán)部分(第三內(nèi)環(huán)區(qū))，是與G蛋白偶聯(lián)的區(qū)域。大多數(shù)常見的神經(jīng)遞質(zhì)受體和激素受體是屬于G蛋白偶聯(lián)型受體。

G蛋白是由α、β、γ亞基組成的三聚體，存在于細(xì)胞膜上，其α亞基具有GTPase活性。當(dāng)配體與受體結(jié)合后，受體的構(gòu)象發(fā)生變化，與α亞基的C-端相互作用， G蛋白被激活，此時(shí)，α亞基與β、γ亞基分離，可分別與效應(yīng)蛋白(酶)發(fā)生作用。此后，α亞基的GTPase將GTP水解為GDP，α亞基重新與β、γ亞基結(jié)合而失活。

⑶單跨膜α螺旋型受體：此型受體只有一段α螺旋跨膜，受體本身具有酪氨酸蛋白激酶活性;或當(dāng)受體與配體結(jié)合后，再與具有酪氨酸蛋白激酶活性的酶分子相結(jié)合，進(jìn)一步催化效應(yīng)酶或蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基磷酸化，也可以發(fā)生自身蛋白酪氨酸殘基的磷酸化，由此產(chǎn)生生理效應(yīng)。

此型受體主要有表皮生長因子受體(EGFR)，胰島素受體(IR)，血小板衍生生長因子受體(PDGFR)等。此型受體的主要功能與細(xì)胞生長及有絲分裂的調(diào)控有關(guān)。

⑷轉(zhuǎn)錄調(diào)控型受體：此型受體分布于細(xì)胞漿或細(xì)胞核內(nèi)，其配體通常具有親脂性。結(jié)合配體的受體被活化后，進(jìn)入細(xì)胞核作用于染色體，調(diào)控基因的開放或關(guān)閉。受體的分子結(jié)構(gòu)有共同特征性結(jié)構(gòu)域，即分為高度可變區(qū)-DNA結(jié)合區(qū)及絞鏈區(qū)-激素結(jié)合區(qū)。①高度可變區(qū)：不同激素的受體此區(qū)的一級(jí)結(jié)構(gòu)變化較大，其功能主要是與調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)有關(guān)。②DNA結(jié)合區(qū)及絞鏈區(qū)：此區(qū)的功能是與受體被活化后向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移(核轉(zhuǎn)位)并與特異的DNA順序結(jié)合有關(guān)。③激素結(jié)合區(qū)：一般情況下，此區(qū)與一種稱為熱休克蛋白90(hsp90)的蛋白質(zhì)結(jié)合在一起而使受體處于失活狀態(tài)。

四、受體與配體的結(jié)合特點(diǎn)：

1.高度的親和力：配體與其受體的結(jié)合具有高度親和力，多數(shù)配體與受體的解離常數(shù)為10-11～10-9mol/L。

2.高度的特異性：指一種激素或細(xì)胞因子只能選擇性與相應(yīng)的受體結(jié)合的性質(zhì)。

3.可逆性：配體與受體通常通過非共價(jià)鍵而結(jié)合。

4.可飽和性：由于存在于細(xì)胞膜上或細(xì)胞內(nèi)的受體數(shù)目是一定的，因此配體與受體的結(jié)合也是可以飽和的。

5.結(jié)合量與效應(yīng)成正比：配體的濃度越大，配體與受體的親和力越大，受體的數(shù)目越多，則配體與受體的結(jié)合量越大，產(chǎn)生的生理效應(yīng)也越大。

五、細(xì)胞信息傳遞途徑：

1.cAMP-蛋白激酶A途徑：

通過這一途徑傳遞信號(hào)的第一信使主要有兒茶酚胺類激素、胰高血糖素、腺垂體的激素、下丘腦激素等。其受體屬于G蛋白偶聯(lián)型膜受體，G蛋白有激活型的Gs和抑制型的Gi兩種。腺苷酸環(huán)化酶(AC)存在于細(xì)胞膜上，可接受G蛋白的信號(hào)而被激活，催化ATP轉(zhuǎn)化為cAMP，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度升高，從而激活蛋白激酶A(PKA)。PKA是一種四聚體，兩個(gè)亞基為催化亞基，兩個(gè)亞基為調(diào)節(jié)亞基。當(dāng)調(diào)節(jié)亞基與cAMP結(jié)合后發(fā)生變構(gòu)(每一調(diào)節(jié)亞基可結(jié)合兩分子cAMP)，與催化亞基解聚，從而使催化亞基激活。PKA可促使多種酶或蛋白質(zhì)絲氨酸或蘇氨酸殘基的磷酸化，改變酶的催化活性或蛋白質(zhì)的生理功能。

2.IP3，Ca2+-CaM激酶途徑：

通過此途徑傳遞信號(hào)的第一信使主要有：①激素：兒茶酚胺、血管緊張素Ⅱ等。②生長因子：PDGF、EGF等。③神經(jīng)遞質(zhì)：乙酰膽堿、5-羥色胺等。其受體可為G蛋白偶聯(lián)型，也可為酪氨酸蛋白激酶型。G蛋白為Gp型。通過Gp蛋白介導(dǎo)，存在于細(xì)胞膜上的PLCβ可被激活;而PLCγ則是在受體的酪氨酸蛋白激酶催化下，其酪氨酸殘基被磷酸化修飾而激活。PLC激活后，可催化膜上的磷脂酰肌醇-4,5-雙磷酸(PIP2)水解成為二脂酰甘油(DAG)及1,4,,5-三磷酸肌醇(IP3)。當(dāng)IP3與存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的IP3受體結(jié)合后，鈣通道開放，貯存于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+釋放進(jìn)入胞液，引起胞液中Ca2+濃度升高。胞液中的鈣調(diào)蛋白(CaM)與Ca2+結(jié)合發(fā)生變構(gòu)，從而激活依賴Ca2+/CaM的蛋白激酶(CaM激酶)，催化數(shù)十種酶或蛋白質(zhì)的磷酸化修飾，產(chǎn)生相應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。

3.DAG-蛋白激酶C途徑：

此途徑的第一信使與IP3，Ca2+-CaM激酶途徑相似，也通過Gp型和另一種G蛋白介導(dǎo)信息，激活磷脂酶C(PLC)和磷脂酶D(PLD)。PLD是存在于細(xì)胞膜上的另一種磷脂酶，在Ca2+的存在下，可將磷脂酰膽堿水解成為磷脂酸(PA)，PA可進(jìn)一步在磷脂酸磷酸水解酶(PAP)的催化下水解生成DAG，是DAG的另一生成途徑。胞液中DAG濃度升高，可致蛋白激酶C激活。該酶可催化底物蛋白質(zhì)絲氨酸或蘇氨酸殘基的磷酸化。經(jīng)典的蛋白激酶C需在Ca2+，DAG和磷脂酰絲氨酸的存在下才能被激活。

4.Ras-MAPK途徑：

已知胰島素和大部分的生長因子經(jīng)此途徑傳遞信號(hào)。主要過程為：EGF + EGFR → SHC磷酸化 → 形成SHC-SOS-GRB2-Ras復(fù)合體 → Ras激活 → Raf-1激酶↑ → MEK1/2 ↑ → ERK1/2 ↑ → 細(xì)胞生長與調(diào)亡。

5.胞內(nèi)受體介導(dǎo)途徑：

通過細(xì)胞內(nèi)受體傳遞信號(hào)的第一信使有：①類固醇激素;②1,25-(OH)2D3;③甲狀腺激素。當(dāng)激素與受體結(jié)合后，引起hsp90與受體解離，受體被活化;活化受體核轉(zhuǎn)移并與HRE結(jié)合;特異基因去阻遏且RNA聚合酶活性增高，特異基因表達(dá)及特異蛋白質(zhì)合成，產(chǎn)生特定的生理效應(yīng)。

第二十一章 癌基因和抑癌基因

一、癌基因的概念及分類：

癌基因(oncogene)是指存在于正常細(xì)胞內(nèi)，與細(xì)胞生長發(fā)育調(diào)控有關(guān)的一組結(jié)構(gòu)基因。癌基因可按其來源不同而分為病毒癌基因(v-onc)和細(xì)胞癌基因(c-onc)。

1.病毒癌基因：

具有致癌性的腫瘤病毒有兩種類型：一種是DNA腫瘤病毒，另一種是RNA病毒即逆轉(zhuǎn)錄病毒。DNA腫瘤病毒的基因組的早期功能基因編碼轉(zhuǎn)化蛋白，如病毒SV40的 A基因編碼大T抗原，分布于胞核，可與p53結(jié)合而使之失活。RNA病毒基因組中可含有致癌基因，并表達(dá)相應(yīng)的轉(zhuǎn)化蛋白，感染動(dòng)物后即可誘發(fā)腫瘤。

2.細(xì)胞癌基因：

細(xì)胞癌基因(c-onc)又稱為原癌基因(protooncogene)，大多數(shù)的原癌基因?qū)儆谡{(diào)控細(xì)胞生長分化的正?；?，原癌基因的蛋白產(chǎn)物是通過影響細(xì)胞生長分化中的控制系統(tǒng)而起作用的。原癌基因激活后可引起細(xì)胞生長分化失控，從而導(dǎo)致細(xì)胞癌變。目前發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞癌基因已超過100種，根據(jù)這些基因表達(dá)蛋白產(chǎn)物的功能可將細(xì)胞癌基因分為四大類：

⑴生長因子類：如c-sis癌基因，其編碼產(chǎn)物為PDGF的β鏈。

⑵G蛋白類：如ras家族，其編碼產(chǎn)物為存在于細(xì)胞膜上的G蛋白，能傳遞生長信號(hào)。

⑶受體及信號(hào)蛋白類：如src家族，其編碼產(chǎn)物為細(xì)胞內(nèi)的生長信號(hào)傳遞蛋白，通常含酪氨酸蛋白激酶活性。

⑷轉(zhuǎn)錄因子類：如myc家族和myb家族，其編碼產(chǎn)物為存在于細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子。

二、癌基因的激活機(jī)制：

1.插入激活：指來源于病毒等的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子插入到細(xì)胞癌基因的附近或內(nèi)部而使其開放轉(zhuǎn)錄。

2.基因重排：基因從正常位置轉(zhuǎn)移到另一位置，常常是插入一啟動(dòng)子后而使其轉(zhuǎn)錄活性增加。

3.基因擴(kuò)增：基因數(shù)量的增加。

4.突變點(diǎn)：ras癌基因的點(diǎn)突變，導(dǎo)致其GTPase活性下降，從而使其保持激活狀態(tài)。

三、抑癌基因及其作用機(jī)制：

抑癌基因又稱為抗癌基因(anti-oncogene)，是指存在于正常細(xì)胞中，其編碼產(chǎn)物能抑制細(xì)胞生長增殖的一組結(jié)構(gòu)基因。常見的抑癌基因有Rb基因，p53基因，p16基因等。其中，Rb基因編碼p105Rb轉(zhuǎn)錄因子，p53基因編碼p53轉(zhuǎn)錄因子，p16基因編碼一種p16蛋白。

1.Rb基因的作用機(jī)制：

Rb基因的失活主要與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的發(fā)生相關(guān)。低磷酸化型的p105Rb可與促進(jìn)細(xì)胞分裂的轉(zhuǎn)錄因子E2F結(jié)合形成復(fù)合物，從而阻止E2F對(duì)某些與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。高磷酸化型的p105Rb則可促使其與E2F轉(zhuǎn)錄因子分離，從而使其呈現(xiàn)活性，細(xì)胞即由G1期進(jìn)入S期。

2.p53基因的作用機(jī)制：

p53蛋白一般都位于核內(nèi)，可與特異的DNA片段結(jié)合。其酸性區(qū)域具有許多轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的共同特征，并與寡聚體的形成有關(guān)。p53蛋白能以四聚體的形式與DNA結(jié)合，調(diào)節(jié)其它基因的表達(dá)。p53蛋白的生物學(xué)功能有：① 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)及抑制細(xì)胞生長的作用：p53蛋白促進(jìn)WAF1/CIP1基因表達(dá)產(chǎn)生一種分子量為21kD的蛋白質(zhì)(p21WAF1/CIP1)，誘導(dǎo)細(xì)胞生長停滯于G1期。② 參與程序性細(xì)胞凋亡：p53 蛋白啟動(dòng)不能修復(fù)的損傷細(xì)胞進(jìn)入程序性凋亡。③ 抑制DNA復(fù)制：p53蛋白與復(fù)制蛋白A(repA)結(jié)合后可抑制其與單鏈DNA的結(jié)合，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期。

第二十三章 分子生物學(xué)常用技術(shù)

一、分子雜交與印漬技術(shù)的原理：

1.分子雜交：

不同來源的單鏈核酸(DNA或RNA)，只要它們具有大致相同的堿基序列，經(jīng)過退火處理，就能重新形成雜種雙螺旋，這一現(xiàn)象稱為分子雜交(molecular hybridization)。利用這一原理，就可以使用已知序列的單鏈核酸片段作為探針，去查找各種不同來源的基因組DNA分子中的同源基因或同源序列。

2.印漬技術(shù)：

印漬技術(shù)的原理首先由Edwen Southern在1975年提出。其基本操作過程是：將DNA片段在瓊脂糖凝膠中電泳分離后，置NaOH液中浸泡，從而將凝膠中的DNA變性為單鏈;然后將一張硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，上面放上大量吸水紙巾，利用吸水紙巾的毛細(xì)作用，將單鏈DNA從凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，再將膜置80℃烘干并使單鏈DNA分子固定在膜上，再用于分子雜交分析。因此，用于DNA印漬的技術(shù)又稱為Southern Blotting或Southern 雜交。

3.探針技術(shù)：

將已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，然后用于分子雜交，雜交后通過放射自顯影、熒光檢測或顯色技術(shù)，使雜交區(qū)帶顯現(xiàn)出來。

二、印漬技術(shù)的類別及應(yīng)用：

1.DNA印漬技術(shù)：又稱為Southern雜交，即DNA-DNA雜交分析。

2.RNA印漬技術(shù)：又稱為Northern雜交，即RNA-DNA雜交分析。

3.蛋白質(zhì)印漬技術(shù)：又稱為Western雜交，或免疫印漬技術(shù)，即利用抗原-抗體反應(yīng)，檢測轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上的特異性蛋白質(zhì)。

三、PCR技術(shù)：

1.PCR的概念：PCR(polymerase chain reaction)即聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)，是指利用耐熱DNA聚合酶的反復(fù)作用，通過變性-延伸-復(fù)性的循環(huán)操作，在體外迅速將DNA模板擴(kuò)增數(shù)百萬倍的一種操作技術(shù)。

2.PCR反應(yīng)系統(tǒng)的組成：

⑴耐熱DNA聚合酶(Taq酶)：這是由耐熱水生細(xì)菌體內(nèi)提取的一種DNA聚合酶。

⑵模板DNA：即待分析的目的DNA，其長度不宜大于10kb。

⑶兩種引物：為了保證DNA聚合酶能夠?qū)蓷l互補(bǔ)鏈均能進(jìn)行延伸，需要兩種引物，分別位于兩條互補(bǔ)模板DNA鏈的3`-端。

⑷四種脫氧核糖核苷酸：用作底物的dNTPS。

⑸緩沖溶液：保證DNA聚合酶催化時(shí)所需的適當(dāng)?shù)娜芤簆H值。

3.PCR的反應(yīng)原理：一般采用變性-復(fù)性-延伸三步循環(huán)，也可采用變性-延伸兩步循環(huán)。

⑴變性：將模板DNA或延伸后的雙鏈DNA加熱到950C，使雙螺旋DNA解開成為單鏈。

⑵復(fù)性：通過降低反應(yīng)溫度至550C，使兩種引物能與兩條解開的DNA互補(bǔ)鏈的3`端粘合。

⑶延伸：將反應(yīng)溫度提高到約700C，在耐熱DNA聚合酶的催化下，合成兩條互補(bǔ)鏈，從而使模板DNA擴(kuò)增一倍。按照上述步驟重復(fù)操作約30次，即可將模板DNA擴(kuò)增數(shù)百萬倍。

4.PCR的主要用途：

⑴目的基因的克隆：是迅速獲得一定量的目的基因的有效方法之一。① 利用特異性引物以cDNA或基因組DNA為模板，獲得已知的目的基因;② 利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中獲得具有同源性的DNA片段;③ 利用隨機(jī)引物從cDNA文庫或基因組文庫中隨機(jī)獲得目的基因。

⑵基因的體外突變：采用隨意設(shè)計(jì)的引物，在體外對(duì)基因進(jìn)行嵌合、缺失、點(diǎn)突變等改造。

⑶DNA的微量分析：由于PCR技術(shù)具有高度敏感性，故可用于微量DNA的分析檢測。

四、DNA堿基序列測定：

DNA堿基序列測定即DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的測定，目前常用的方法為Maxam-Gilbert建立的化學(xué)裂解法和Sanger建立的雙脫氧末端終止法。雙脫氧末端終止法的主要操作步驟有：

1.獲得待測DNA片段的單鏈模板：一般采用基因工程的方法以獲取一定數(shù)量的單鏈待測DNA模板?？蓪⒋郎yDNA片段與噬菌體M13DNA進(jìn)行重組，然后將其導(dǎo)入大腸桿菌進(jìn)行增殖，M13噬菌體一般以單鏈DNA形式透出細(xì)胞再感染新的細(xì)菌，故此可獲得單鏈DNA模板。

2.合成寡核苷酸引物：利用DNA合成儀合成一段與待測DNA片段的3’-端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。

3.模板-引物雜交：將待測單鏈DNA模板與寡核苷酸引物混合，并進(jìn)行保溫處理，使引物與DNA單鏈模板的3’-端進(jìn)行雜交。

4.互補(bǔ)鏈的延長和終止：將上述雜交混合液分為四份，每份混合液中均加入DNA聚合酶，四種dNTPS，一種帶放射性同位素標(biāo)記的脫氧核糖核酸(如α-32P-dATP)。此外還需分別加入一種雙脫氧核糖核酸(ddATP，ddGTP，ddCTP或ddTTP)。然后在適當(dāng)溫度條件下延伸互補(bǔ)鏈，就可得到四組分別以A、G、C、T、終止的長短不一的互補(bǔ)鏈的混合物。

5.電泳分離：將四組含有長短不等的反應(yīng)混合物在同一聚丙烯酰胺凝膠板上進(jìn)行電泳，即可將只相差一個(gè)核苷酸的寡核苷酸鏈分離開。

6.放射自顯影：將電泳凝膠進(jìn)行放射自顯影，即可得到放射自顯圖譜，通過該圖譜即可直接讀出核苷酸的排列順序。

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（責(zé)任編輯：何以笙簫默）

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